Экспресс-методы контроля бруцеллеза животных: РБП (роз бенгал проба) и КР (кольцевая реакция) с молоком

Бруцеллез – хронически протекающая болезнь животных и человека, вызываемая бактериями, объединёнными под общим названием Brucella. По классификации (2015 г.) Объединенного Комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу род Brucеlla состоит из 11 видов, которые подразделяются на ряд биоваров: Brucella melitensis (мальтийская), Brucella abortus (Brucella bovis, бычья), Brucella suis (свиная) и Brucella canis (собачья).

Бруцеллез различных видов встречается на всех континентах, включая и Антарктиду. К бруцеллезу восприимчивы 60 видов позвоночных животных, 30 видов кровососущих клещей, двух блох, двух видов комаров, а также домовые мухи, рептилии, амфибии, дельфины, киты, каланы и рыбы.

В период с 2008 года по первое полугодие 2020 года в России зарегистрировано 4854 неблагополучных пунктов с заболеванием КРС, в которых выявлено 115 980 голов больных животных и 527 неблагополучных пунктов по бруцеллезу мелко­го рогатого скота (МРС), в которых зарегистрировано 19 866 больных овец и коз.

Важным звеном в ликвидации бруцеллеза животных является своевременная диагностика. Диагноз бруцеллез устанавливают на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотических данных, а также клинических и патологоанатомических признаков болезни.

Наиболее информативный метод прижизненной диагностики бруцеллеза является серологический метод, основанный на иммунологических реакциях, в основе которых лежат специфические взаимосвязи между антителом и антигеном.

Через неделю после развития заболевания в крови появляются иммуноглобулины класса М (IgM), концентрация которых достигает максимального значения в течение первых нескольких недель, а затем постепенно снижается (острая фаза заболевания), и на 2-3 неделе образуются сывороточные IgG и немногим позже – IgA. Для хронического бруцеллеза характерно отсутствие специфического IgM, в крови возможно циркуляция IgA и IgG или одного из них.

В настоящее время в РФ применяются 14 диагностических (серологических) тестов на бруцеллез (РА, РСК, РНГА, РИД с О-ПС антигеном, РБП, КР с молоком, ИФА и др.). Часто практические специалисты задают вопросы, почему такое количество серологических реакций и нельзя ли меньшим количеством реакций получить максимальный достоверный результат?

В связи с тем, что бруцеллез протекает своеобразно почти у каждого в отдельности взятого животного, в зависимости от возраста, пола, беременности, физиологического состояния, вирулентности возбудителя и др., то в одном и том же неблагополучном стаде при возникновении инфекции наблюдаются индивидуумы, резко отличающие по времени и напряжению продукции антител. Поэтому показания одной и той же реакции выраженно колеблются в зависимости от давности течения болезни и степени ее патологического проявления. Так, недавно инфицированные животные реагируют в РА в большем проценте, чем длительно болеющие. Истощенные животные могут не реагировать, либо реагировать очень слабо по всем реакциям.

Поэтому считается общепризнанным, что при постановке двух, трех, четырех и более серологических реакций выявляется больных животных больше, чем при одной какой-либо реакции.

Однако, ориентировочный (требующий подтверждения) диагноз на бруцеллез у животных можно установить с помощью простых серологических тестов: роз бенгал пробы (РБП) и кольцевой реакции (КР) с молоком, не требующих лабораторных условий, выполняемых непосредственно на фермах.

Роз бегал проба (РБП)

По сравнению с другими методами серологической диагностики бруцеллеза РБП обладает следующими преимуществами: высокой чувствительностью, способностью в короткие сроки после заражения выявлять специфические бруцеллезные антитела (широкий набор классов и подклассов IgM, IgG, IgA) и благодаря кислой реакции антигена ингибировать проявления неспецифических антител, а также стабильностью показаний, технической простотой постановки, требующей небольшой затраты труда и времени, четкостью и быстротой получаемых результатов.

Метод:

Сущность метода заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розового цвета.

РБП применяют как экспресс-метод диагностики бруцеллеза у не иммунизированного противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота, яков, буйволов, зебу, коз, овец, лошадей, верблюдов, северных оленей (маралов), свиней и собак.

Перед постановкой реакции антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30-40 минут при комнатной температуре. Антиген тщательно встряхивают.

Реакцию проводят на чистых эмалированных пластинах или изразцовых плитках с лунками при температуре не ниже 18°С. Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки шприцом – полуавтоматом или микропипеткой. При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки для антигена или микропипетки вносят 0,03 мл (2 капли) антигена, а при исследовании сывороток крови овец, коз, северных оленей (маралов), свиней, собак - 0,015 мл (1 каплю) антигена. Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой активными движениями ручного смесителя до получения однородной жидкости, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают осторожными вращательными движениями или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. Реакцию учитывают невооруженным глазом в течение 4 минут после смешивания сыворотки с антигеном при слегка наклоненном положении пластинки. При положительной реакции в течение 4 минут появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета. Агглютинацию, которая происходит позже 4 минут, не учитывают.

В начале работы ставят контроль антигена с негативной и позитивной бруцеллезной сыворотками в тех дозах, а также антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 мл физиологического раствора добавляют 0,03 мл антигена).

Результат:

Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна равномерно окрашена).

В благополучных по бруцеллезу хозяйствах все сыворотки крови от животных, с которыми получена положительная РБП, в тот же день или на другой день исследуют в РА РСК (РДСК) или РА И РИД.

При получении положительных, отрицательных или сомнительных результатов в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД их оценку проводят в соответствии с действующими санитарными и ветеринарными правилами.

Кольцевая реакция (КР) с молоком

Высокую оценку КР с молоком получила как в нашей стране, так и за рубежом. Все исследователи отмечают выраженную чувствительность, доступность и быстроту метода. С помощью этой реакции обследуют молочные фермы не менее 3-4 раз в год и рыночное молоко, при этом пробы молока отбирают прямо от коров при доении из бидонов любого объема.

Метод:

Сущность реакции состоит в выявлении антигеном специфических антител в молоке больных бруцеллезом или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами коров. Положительная реакция проявляется в образовании синего кольца в верхнем слое сливок.

Комитет экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу (шестой доклад, 1986) считает, что в молоке, как и в сыворотке крови крупного рогатого скота, присутствуют в различных сочетаниях изотипы IgG_1, IgG₂ и IgA. Причем IgA, являющийся секреторным иммуноглобулином, в молоке находится в значительном большем количестве, чем в сыворотке крови и, следовательно, играет главную роль в кольцевой реакции.

Методика постановки КР с молоком достаточна проста. В пробирки (лучше Флоринского) вносят 2 см³ молока пипеткой или дозатором. Антиген вносят по 0,1 см³ в каждую пробирку с пробой молока. При исследовании каждой партии молока ставят контрольные пробы:

- молоко от здоровой коровы (буйволицы);

- смесь молока здоровой коровы (буйволицы) с бруцеллезной сывороткой (0,1 см³ сыворотки на см³ молока).

После внесения антигена пробирки встряхивают и выдерживают на водяной бане при температуре 37-38°С в течение 1 часа или в термостате в течение 2 часов.

Результат:

Результаты реакции учитывают визуально через 30-40 минут после извлечения штативов из водяной бани (термостата) и оценивают в крестах по следующей схеме:

- (+++) три креста - четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;

- (++) два креста - четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет;

- (+) один крест - синее кольцо в слое сливок выражено слабо и весь столбик молока имеет синий цвет;

- (-) минус - столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок белого или слегка желтоватого цвета.

Все пробы молока с оценкой в (+++) три креста и (++) два креста считают положительными, (+) один крест - сомнительным.

При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотку крови животных стада, в котором выявлены особи, сомнительно или положительно реагирующие в КР с молоком, исследуют на бруцеллез в РБП или в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА. При этом проводят клинический осмотр животных и исключают их заболевание маститами.

При получении положительных результатов исследуемых сывороток крови на бруцеллез с животными стада поступают в соответствии с действующими санитарными и ветеринарными правилами.

Заключение

Таким образом две серологические реакции: роз бенгал проба (РБП) и кольцевая реакция (КР) с молоком являются прижизненными предварительными экспресс - диагностическими тестами бруцеллеза животных в благополучных стадах. Эти серологические реакции просты в использовании и выполняются в полевых условиях.

Тест-системы для диагностики бруцеллеза животных в роз бенгал пробе (РБП) и кольцевой реакции (КР) с молоком выпускаются ФКП «Щелковский биокомбинат» и качество их соответствуют всем международным требованиям.

Николай Иванович Зенов, д.в.н., советник директора по производству ФКП "Щелковский биокомбинат",

Марина Сергеевна Чумакова, ветеринарный врач, специалист по продвижению биопрепаратов ФКП "Щелковский биокомбинат"